Saturday, May 17, 2008

praktikum Biologi Molekuler

ISOLASI DNA TANAMAN

oleh :

Hamdani Mahbub Junaidi

JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MIPA

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

----------------------------------------------------------------------------------------------

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Sel-sel tanaman seperti halnya sel-sel hewan, sel-sel tanaman juga mengandung informasi genetik yang nantinya informasi tersebut dapat diturunkan kepada generasi berikutnya. Informasi genetik ini dikode dalam suatu molekul besar DNA yaitu kromosom. Pada sel tanaman ini DNAnya dibagi menjadi DNA intrakromosomal dan ekstrakromosomal. DNA intrkromosomal merupakan DNA yang ditemukan di inti sel. Sedangkan DNA ekstrakromosomal merupakan DNA yang ditemukan di sitoplasma sel. Pada sel-sel tanaman DNA ekstrakromosal ini dapat ditemukan di mitokondria dan kloroplas (Farrel, 2004).

Kemampuan mengisolasi DNA tanaman sangat diperlukan karena sangat bermanfaat dalam kajian ilmu biologi molekuler dan ilmu lainnya. Hal ini berkaitan dengan pemanfaatan hasil analisis dari DNA tanaman yang dapat digunakan untuk berbagai macam hal, seperti mengetahui hubungan kekerabatan, evolusin dan lain seabagainya. Selain itu, kemampuan dalam mengisolasi DNA tanaman juga diperlukan dalam menentukan letak gen-gen yang termutasi pada tanaman transgenik ataupun untuk menentukan letak gen-gen yang mengkode sifat unggul dalam pembatan tanaman tansgenik yang memiliki sifat unggul (Heldt, 2005). Karena pentingnya mengetahui cara mengisolasi DNA tanaman, maka praktikuum tentang Iolasi DNA Tanaman sangat perlu dilakukan.

1.2 Rumusan Masalah

Permasalahan dalam praktikum Isolasi DNA tanaman ini adalah bagaimana cara mengisolasi DNA tanaman tertentu, dan apakah terdapat perbedaan DNA antara DNA tanaman yang satu dengan DNA tanaman yang lainya.

1.3 Tujuan

Tujuan dilaksanakannya praktikum Isolasi DNA Tanaman ini adalah mengetahui cara mengisolasi DNA tanaman yang baik dan benar, serta mengetahui DNA tanaman tertentu.

1.4 Manfaat

Manfaat yang diharapkan setelah dilakukanya praktikum tentang DNA tanaman ini adalah praktikan bisa mengetahui dan bisa mengisolasi DNA tanaman tertentu secara baik dan benar, serta bisa membandingkan DNA antara tanaman yang satu dengan tanaman yang lainya.


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Sel tanaman mempunyai tiga genom di dalam selnya, yaitu di dalam nukleus, mitokondria dan plastid. Informasi genetik pada mitokondria dan plastid terletak pada DNA sirkular yang terdiri dari pita double heliks, dengan banyak kopi yang terdapat di tiap organel. Informasi genetik mitokondria dan plastid diturunkan secara maternal dan predominan dari generasi ke generaasi (Heldt, 2005). Isolasi DNA tanaman pada umumnya berhasil bila dilakukan pada tanaman yang masih segar, meskipun isolasi DNA dari tanaman dapat dilakukan pada semua bagian tanaman, embrio bahkan herbarium. Tanaman yang segar bila tidak langsung digunakan harus disimpan pada kondisi yang dingin (-200C atau -800C) dan lembab untuk menjaga kondisi sel tanaman agar DNA yang ada di dalamnya tidak rusak. Salah satu teknik yang digunakan untuk solasi DNA tanaman ini adalah dengan menggunakan CTAB (cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide). CTAB merupakan detergen yang berguna untuk melarutkan membran plasma sel dan akan membentuk komplek dengan DNA. CTAB adalah detergen yang berkation yang akan membentuk komplek presipitasi dengan DNA ketika konsentrasi NaCl di bawah 0,7 M. Presipitasi DNA dari buffer CTAB dengan adanya etanol atau isopropanol sering menghasilkan massa bergelatin yang komposisinya tidak diketahui. DNA pada umumya terlihat jelas dalam massa tersebut, tetapi sulit untuk memisahkannya, sehingga untuk menghindari terbentuknya massa ini digunakan presipitasi yang tidak menggunakan alcohol (Chawla, 2003).

Larutan buffer yang biasa digunakan dalam teknik isolasi DNA tanaman adalah CTAB (Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide). Larutan ini dapat melarutkan membrane plasma dan akan membentuk komplek dengan DNA. Salah satu keunggulan metode ini adalah tidak dibutuhkannya persiapan yang panjang untuk jaringan tanaman dan dapat digunakan untuk berbagai jenis jaringan termasuk daun, akar, biji, embrio, endosperma dan pollen serta kultur suspensi. Metode ini juga dapat diaplikasikan dari ukuran sampel mulai miligram herbarium, jaringan yang telah menjadi fosil hingga beberapa gram jaringan yang baru (Chawla, 2003).

Secara umum metode yang digunakan untuk mengisolasi DNA antara lain sebagai berikut Chawla (2003):

1. Melisiskan dinding sel untuk mengeluarkan isi sel, yang dilakukan dengan menggerus jaringan pada nitrogen cair dengan mortar

2. Mengganggu keseimbangan sel membrane sehingga DNA dapat dikeluarkan ke dalam larutan buffer, dilakukan dengan penggunaan larutan detergen seperti SDS (Sodium Dodecyl Sulfat), CTAB (Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide).

3. Penggunaan EDTA (Etylen Diamine Tetra Acetic Acid) untuk melindungi DNA dari aktivitas endogenous nucleases karena EDTA ini merupakan pengkelat ion yang dibutuhkan sebagai kofaktor sebagian besar nucleases.

4. Campuran jaringan/buffer diemulsi oleh fenol kloroform untuk mendenaturasi dan memisahkan protein dari DNA dan genom DNA dapat dipresipitasi menggunakan ethanol atau isopropanol.

5. Meminimalisasi pemotongan DNA.

Setelah tahapan presipitasi, DNA selanjutnya dipresipitasi dengan menggunakan ethanol absolute. Penambahan larutan garam seperti amonium asetat juga sangat membantu presipitasi DNA. Sedangkan ethanol 70% yang ditambahkan setelah presipitasi ini dapat digunakan sebagai larutan pencuci. DNA hasil kemudian ditambahkan dengan TE dan disimpan dalam frezer suhu -20ºC (Birren dkk, 1997).

Purifikasi DNA dapat diekstraksi menggunakan ekstraksi phenol. Purifikasi ini juga bisa dilakukan dengan menambahkan larutan phenol : chloroform: isoamyalcohol (25:24:1) dengan volume sama dengan volume sampel DNA. Pada lapisan phenol yang merupakan pelarut organik, akan terlarut lipid, polisakarida dan protein. Sampel DNA akan tertinggal pada lapisan aqueous. Chloroform juga merupakan larutan perlarut juga menstabilkan ikatan tidak stabil antara lapisan organik dan aquaeus. Isoamilalkohol juga sebagai larutan penstabil dan mencegah adanya busa (Protocols Online, 2008).

Elektroforesis merupakan teknik yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan fragmen-fragmen DNA ataupun RNA. Prinsip elektroforesis adalah memisahkan molekul berdasarkan muatannya. DNA yang bermuatan negativ karena adanya phosphate akan bergerak ke arah kutub positif selama elektroforesis. Fragmen DNA mempunyai muatan negative yang sama untuk tiap-tiap ukuran panjang, sehingga pergerakan DNA ini akan memiliki kecepatan yang sama untuk mencapai kutub positif (Clark dan Christopher, 2008).

Pergerakan yang sama antar molekul DNA ini tidak akan dapat digunakan untuk memisahkan DNA berdasarkan ukurannya. Hal inilah yang menyebabkan digunakannya gel untuk memperlambat pergerakan DNA. Gel ini merupakan polymer sehingga akan membentuk semacam jaring-jaring untuk memerangkap DNA. DNA dengan ukuran yang lebih besar akan lebih sulit melewati lubang atau pori dari gel, sehingga DNA dengan sendirinya akan terpisah berdasarkan besarnya ukuran karena kemampuan dari DNA yang berbeda-beda dalam melewati pori dalam gel (Clark dan Christopher, 2008).

Biji kacang tanah mengandung kadar lemak dan protein tinggi. Kandungan proteinnya sekitar 25-34%, terdiri dari asam-asam amino esensial seperti arginin, fenilalanin, histidin, isoleusin, leusin, lisin, metionin, triptofan, dan valin. Kandungan lemaknya sekitar 16-50%, 76-86% di antaranya adalah asam lemak tidak jenuh seperti asam oleat dan linoleat. Kacang tanah mengandung anti oksidan, yaitu senyawa tokoferol, selain itu mengandung arakhidonat, dan mineral (Kalsium, Magnesium, Phosphor, dan Sulfur), serta vitamin (riboflavin, thianin, asam nikotinik, vitamin E, dan vitamin A). Kacang tunggak memiliki kandungan protein sekitar 25% (Biogen, 2008).


BAB III

METODE PRAKTIKUM

3.1. Waktu dan Tempat

Praktikum tentang Isolasi DNA Tanaman dilaksanakan pada hari Rabu tanggal 19 Maret 2008, pukul 13.00 WIB-17.00 WIB dilaboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Uneversitas Brawijaya Malang.

3.2. Peralatan dan Bahan

Bahan yang diperlukan dalam praktikum ini adalah daun muda tanaman yang telah dibekukan, CTAB buffer ekstrak (2% CTAB; 100 mM tris-HCl pH 8; 20 mM EDTA pH 8; 1,4 NaCl : disterilkan dengan autoclave, disimpan dalam suhu ruang, kemudian ditambahkan 2 % B-merkaptoethanol; 0,1 mg/mol protein K sesaat sebelum digunakan), PCI (fenol : isoamilalkohol = 25:24:1), nitrogen Cair (N2 liquid), 7,5 ammonium sulfat, EtOH 70 %, TE Buffer (pH 7,6), larutan Ethanol : Kloroform.

Sedangakan peralatan yang digunakan dalam praktikum ini adalah penggerus mortar, eppendorf, vorteks, freezer, water bath, sentrifus, mikropippet, sarung tangan dan masker.

3.3. Cara Kerja

Daun muda yang telah dibekukan dipilih dan diambil sebanyak 0,1 g, digerus dengan nitrogen cair, kemudian ditambahkan 700 µl bufer ekstrak, dipindah ke eppendorf dan divorteks. Kemudian tabung eppendorf yang berisi homogenat diinkubasi dalam water bath 650 C selama 30 menit. Kemudian disentrifus 13000 rpm selama 10 menit pada suhu 40 C. Supernatanya dipindahkan ketabung eppendorf baru, kemudian ditambahkan PCl dengan volume sama dan divorteks. Kemudian disentrifugasi 13000 rpm selama 5 menit pada suhu 40 C. Supernatanya dipindahkan ketabung eppendorf baru kemudian ditambahkan Cl dengan volume sama dan divorteks. Kemudian disentrifugasi 13000 rpm selama 5 menit pada suhu 40 C. Supernatanya dipindahkan ketabung eppendorf baru, kemudian ditambahkan ammonium asetat 7,5 M (0,1 vol) dan divorteks. Diinkubasi selama 1 jam pada suhu -200 C. Disentrifugasi 13000 rpm selama 15 menit pada suhu 40 C. Supernatanya dibuang kemudian pelet ditambah ethanol 70% sebanyak 500 µl dan dihomogenkan secara perlahan. Setelah disentrifugasi, supernatan dibuang, pelet dikeringkan dalam inkubator suhu 550 C. DNA yang berupa pelet dilarutkan dalam 20 µl H2O. DNA dapat disimpan pada suhu - 200 C untuk jangka panjang.


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Analisa Prosedur

Dalam praktikum Isolasi DNA Tanaman digunakan lima macam sample kacang, yaitu kacang koro, kacang panjang kuncang tunggak, kacang buncis dan kacang lanjaran, hal ini dilakukan untuk mengetahui perbedaan DNA yang terdapat pada kelima kacang tersebut dan untuk mengetahui tingkat kemurnian isolasi DNA pada kelima kacang tersebut. Kacang-kacang tersebut diambil daun mudanya 0,1 g karena daun mudah dihancurkan dan untuk memperoleh DNA yang aktif beraktifitas. Ditambahkan N2 cair untuk membekukan daun sehingga mempermudah penggerusan. Kemudian daun-daun tersebut digerus untuk menghancurkan sel daun. Ditambahkan dengan CTAB untuk melysiskan dinding sel, membran sel, menjaga kondisi fisiologi sel dan menjaga pH. Dimasukkan tabung eppendorf dan divorteks untuk mempermudah perlakuan dan untuk menghomogenkan larutan yang terdiri dari fragmen sel dengan CTAB buffer extrak. Diinkubasi dalam water bath 650 C selama 30 menit untuk mengoptimalkan kerja CTAB buffer lysis. Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 10 menit pada suhu 40 C untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan berat molekulnya. Kemudian supernatanya dimashkkan kedalam tabugn eppendorf baru dan ditambahkan PCI dengan volume yang sama dengan supernatan, dimana phenol berfungsi untuk presipitasi DNA, chloro untuk membersihkan saisa fenol, dan Iodin adalah pelarut organik untuk menghilangkan protein.

Larutan yang didapatkan divorteks agar homogen, disentrifuse 12000 rpm 5 menit dalam suhu ruang untuk memisahkan fragmen sel berdasarkan berat molekulnya. Kemudian supernatan diambil dan dipineahkan kedalam tabung eppendorf baru dan ditambahkan dengan CI dengan volume yang sama dengan volume CI, dimana chloro merupoakan pelarut organik yang berfungsi untuk menghilkangkan protein dan iodin berfungsi untuk menghilsangkan fenol. Kemudian divorteks untuk menghomogenkan. Disentrifuse 12000 rpm pada suhu 40 C selama 5 menit untuk memisahkan fragmen DNA dengan debris berdasarkan molekul. Kmeudian supernatanya ditambahkan dengan ammonium asetat dengan volume 0,1 X volume supernatan yang berfungsi untuk salting out, separasi DNA dari RNA, ditambahkan EtOH absolut ),2 X volume supernatan yang berfungsi untuk presipitasi.

Setelah ditambahkan dengan ammonium asetat dan EtOH absolut, larutan divorteks agar homogen. Kemudian diinkubasi pada suhu -200 C selama 2 jam agar kerja ammonium dan EtOH absolut bekerja obtimal. Kemudian disentrifugasi selama 12000 rpm selama 15 menit pada suhu 40 C untuk meisahkan komponen berdasarkan berat molekulnya. Kemudian pelet ditambahkan dengan ETOH 70 % dengan volume 500 µl untuk mencuci DNA dari ethanol absolut dihomogenkan perlahan untuk mencampur larutan, disentrifuse dengan kecepatan 12000 rpm selama 15 menit pada suhu 40 C untuk memisahkan supernatan yang berupa debris dan pelet yang berupa DNA berdasarkan berat molekulnya. Supernatan dibuang dan pelet dikeringkan pada suhu 550 C untuk mendapatkan DNA kering. Pelet ditambahkan 50 µl TE buffer (pH 7,6) yang berfungsi sebagai pelarut DNA. Pada waktu elektroforesis digunakan panajang gelombang 230 karena Panjang gelombang 230 nm merupakan panjang gelombang yang mendekati panjang gelombang maksimum dan memberikan kondisi analisis yang baik untuk analisis DNA tanaman (bebas dari gangguan pelarut) (Harahap, 2007)

4.2 Analisa Hasil

Praktikum Isolasi DNA tanaman ini menggunakan lima macam jenis tanaman kacang-kacangan, yaitu kacang koro, kacang panjang kuncang tunggak, kacang buncis dan kacang lanjaran. Pada praktikum ini dilakukan uji kualitatif dengan menggunakan elektroforesis dan uji kuantitas dengan menggunakan spektrofotometer. Hasil uji kualitatif dapat dilihat pada tabel 1 berikut ini :

Tabel 1. Hasil spektrofotometer dari Isolasi DNA Tanaman.

No

Sample

Å 230

Å 260

Å 280

Kontaminasi polisakarida

Kemurnian

Konsentrasi

Å 230/ Å 260

1

Koro 1

0,072

0,112

0,078

0,643

1,436

1120

2

Koro 2

0,038

0,039

0,028

0,974

1,393

390

3

k. pjg 1

0,094

0,085

0,047

0,106

1,808

850

4

k. pjg 2

0,092

0,013

0,021

7,076

0,619

130

No

Sample

Å 230

Å 260

Å 280

Kontaminasi polisakarida

Kemurnian

Konsentrasi

Å 230/ Å 260

5

Tunggak 1

0,019

0,011

0,031

1,727

0,355

110

6

Tunggak 2

0,084

0,063

0,038

1,333

1,658

630

7

Buncis 1

0,145

0,262

0,145

0,553

1,807

2620

8

Buncis 2

-

-

-

-

-

-

9

Lanjaran 1

0,080

0,010

0,011

8

0,909

100

10

Lanjaran 2

0,069

0,028

0,011

2,464

2,454

280

Data pada table 1 menunjukkan tingkat kontaminasi polisakarida pada isolasi DNA tanaman dan menunjukkan tingkat kemurnian DNA tanaman yang kita isolasi pada konsentrasi tertentu. Dapat dilihat pada tabel tersebut, bahwa tingkat kontaminasi polisakarida yang tertinggi adalah pada kacang lanjaran 1 dan kacang panjang 1 dimana tingkat kontaminasi lanjaran 1 adalah 8 dan nilai kontaminasi kacang panjang 2 adalah 7,076. Sedangkan nilai tingkat kontaminasi yang terendah adalah kacang panjang 1 dengan nilai kontaminasi polisakarida adalah 0,106. sedangkan jika dikaji dari nilai kemurnianya, maka dapt dilihat bahwa sample yang mempunyai nilai kemurnian yang paling tinggi adalah kacang buncis 1 dengan nilai kemurnianya adalah 1,807 dan kacang panjang dengan nilai kemurniaanya adalah 1,808. jika dihubungkan antara kontaminasi polisakarida dan kemurnian DNA maka dapat dilihat bahwa polisakarida sangat mempengaruhi hasil kemurnian isolasi DNA, dapat dilihat bahwa kacang lanjaran 1 dengan nilai kontamisani polisakarida sebesar 8 nilai kemurnian DNAnya adalah 0,909, hal ini berbeda jauh dengan kacang panjang 1 yang mempunyai nilai kontaminasi polisakarida 0,106 mempunyai nilai kemurnian 1,808. sedangkan pada sampel kacang lanjaran 1 nilai kemurnian DNA lebih dari dua, sedangkan nilai kontaminasi menunjukkan 2,464, hal ini kemungkinan tidak hanya polisakarida saja yang mempengaruhi hasil ,namun juga ada faktor lain yang mempengaruhi, misalnya saja RNA.

Bila nilai kemurnian DNA kurang dari 1. 8 menunjukkan adanya kontaminan protein. Sedangkan nilai kemurnian DNA yang diatas 2. 0 menunjukkan kontaminasi oleh RNA. Kontaminasi ini dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor diantaranya adalah kontaminasi dari sampel yang akan diisolasi DNAnya. DNA murni memiliki nilai kemurnian antara 1,8 – 2.0 Nilai kemurnian yang kurang dari 1,8 berarti bahwa DNA tersebut terkontaminasi oleh protein (Clark dan Christopher, 2001).




Keterangan :


1. Kacang koro 1

2. Kacang koro 2

3. Kacang panjang 1

4. Kacang panjang 2

5. Kacang tunggak 1

6. Kacang tunggak 2

7. Kacang buncis 1

8. Kacang lanjaran 1

9. Kacang lanjaran 2

10. Kacang koro 1

11. Kacang koro 2

12. kacang panjang 1

13. kacang panjang 2

14. kacang tunggak 1

15. kacang tunggak 2

16. kacang buncis 1

17. kacang lanjaran 1


Tabel 2. Zimogram hasil elektroforesis

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17


++

+



+++

+

++



++




+++

++

Pada gel hasil elektroforesis yang dilakukan dan skema yang dapat dilihat pada zimogram, maka dapat dilihat bahwa pada sample kacang koro 1 bahwa pada gel semuanya terbentuk smear, hal ini dapat disimpulkan bahwa sample tersebut telah terkontaminasi. Dan pada sample kacang panjang 1 terbentuk band, namun masih terdapat smear yang menandakan bahwa sample masih terkontaminasi, hal yang sama juga ditemukan pada kacang buncis, namun band yang terbentuk lebih tebal. Sedangkan pada kacang lanjaran 1 dan kacang lanjaran 2, band sudah terbentuk dan tidak terdapat smear, hal ini menunjukkan bahwa sample tersebut sedikit terkontaminasi atau bahkan tidak terdapat kontaminasi.

DNA pada saat elektroforesis tidak keluar dengan baik, ada beberapa kemungkinan, diantaranya adalah (Pierroton, 2008) :

1. Tidak terdapat DNA pada sample yang dimasukkan

2. DNA tidak dalam bentuk terlarut (ketika DNA dipresipitasi, banyak terdapat kontaminasi yang tidak disuspensikan kembali menjadi larutan)

3. DNA tidak keluar sama sekali karena sample sangat terkontaminasi protein atau polisakarida dan komponen fenolik


BAB V

KESIMPULAN

5.1 Kesimpulan

Praktikum Isolasi DNA Tanaman menggunakan 5 sample daun tanaman yaitu kacang koro, kacang panjang kuncang tunggak, kacang buncis dan kacang lanjaran. Dari praktikum yang dilakukan, maka didapatkan hasil bahwa sample yang mengalami kontaminasi polisakarida paling banyak adalah kacang lanjaran 1 dan kacang tunggak. Sedangkan sample yang mempunyai tingkat kemurnian yang paling tinggi adalah kacang panjang yaitu sekitar 1,808 dan kacang buncis yaitu sekitar 1,807. sedangkan sample yang mengalami kontaminasi RNA paling tinggi adalah kacang lanjaran 2 yang ditandai dengan nilai kemurnian lebih dari 2 yaitu sekitar 2,464.

5.2 Saran

Pada praktikum ini sebaiknya digunakan sampel tanaman yang berasal dari 1 spesies saja namun beda strain, sehingga bisa diketahui perbedaan masing-masing strain dan mungkin bisa diketahui pula keuntungannya, terutama untuk tanaman transgenik.


DAFTAR PUSTAKA

Birren,B.; E.D. Green; S. Klapholz; R.M. Myers;J. Roskams. 1997. Genome Analysis. A Laboratory manual. Volume 1. Cold Spring Harbour Laboratory Press.New York. Halaman 621

Biogen . 2008 plasma nutfah Indonesia. http:// biogen.litbang.deptan.go.id/berita_artikel/mengenal_plasmanutfah.php. tanggal akses 24 Maret 2008.

Chawla, H. S. 2003. Plant Biotechnology : A Practical Approach. Science Publishers, Inc. Plymouth.

Clark, W. dan K. Christopher. 2008. An Introduction to DNA : Spechtrophotometry, Degradation, and the “Frangekel” Eksperimen http://www. zoo. utoronto. ca/ able/ volumes/ vol-22/5-clark. pdf. Tanggal akses 20 Oktober 2007.

Farrel, R.E. 2004. RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization. Third Edition. Elsevier Academis Press. London. Hal. 693-705

Harahap. 2007. spektrofotometer panjang gelombang 230. jurnal.farmasi.ui.ac.id/pdf/2006/v03n02/hayun0302.pdf. tanggal akses 26 Maret 2008.

Heldt, H. W. 2005. Plant Biochemistry. Third Edition. Elsevier Academic Press. California. Hal. 491

Protocols Online. 2008. Agarose Gel Electrophoresis. http://www.protocol-online.org/prot/Molecular_Biology/ eleectrophoresis/Agarose_Gel_Electrophoresis/index.html. Diakses tanggal 18 Oktober 2007.

Pierroton. 2008. Gel Agarose Trouble Shooting.http://www.pierroton.inra.fr/genetics/labo/protocol.html. tanggal akses 24 maret 2008.



No comments:

anda pengunjung ke

Hubble Images