JUNEs BLOG

DETEKSI DAN UJI KUALITAS AMILASE

2008-05-18T20:25:00.000-07:00

DETEKSI DAN PRODUKSI AMILASE

oleh :

Hamdani Mahbub Junaidi

------------------------------------------------------------------------------------------

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Sebagian besar mikroorganisme memindahkan berbagai macam molekul kecil melewati sel-sel atau membran plasma dan memetabolismenya. Substansi ini termasuk glukosa, asam amino, peptida kecil, nukleotida dan phosphat serta ion organik lainnya. Sebagai tambahan, untuk endoenzim yang diproduksi untuk digunakan sel, banyak bakteri (dan fungi) memproduksi eksoenzim dan melepaskannya melalui sel atau membran plasma. Enzim (eksoenzim) yang berperan dalam merubah karbohidrat komplek adalah karbohidrase, amilase, selulase. Pati merupakan substansi yang terlebih dahulu harus diubah menjadi molekul lebih sederhana agar dapat diserap oleh sel. Mikroorganisme memproduksi enzim untuk memecah substansi di dalam sel, salah satunya adalah amilase (Black, 2005).

Amilase juga banyak digunakan pada industri makanan. Amilase dapat digunakan sebagai pengontrol viskositas sirup cokelat dan minuman beralkohol (brewing). Amilase diproduksi oleh banyak jenis mikrobia, akan tetapi mikrobia yang sering digunakan dalam skala industri adalah Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloquaifaciens dan Aspergillus niger (Inchem, 2008). Oleh karena pentingnya enzim amilase, maka praktikum tentang Isolasi dan Deteksi Amilase perlu sekali dilakukan.

1.2 Tujuan

Adapun tujuan dilaksanakan praktikum tentang Isolasi dan Deteksi Amilase adalah untuk mempelajari deteksi adanya enzim amilase, mempelajari proses produksi amilase dan mempelajari uji enzim amilasi yang telah diproduksi.

1.3 Manfaat

Manfaat yang diharapkan pada praktikum ini adalah bisa mendeteksi bakteri-bakteri apa saja yang bisa memproduksi amilase, bisa menghasilkan amilase dengan mikroorganisme tertentu, serta mengetahui kualitas suatu amilase yang dihasilkan oleh bakteri tertentu.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Enzim Amilase

Enzim adalah molekul biopolimer yang tersusun dari serangkaian asam amino dalam komposisi dan susunan rantai yang teratur dan tetap. Enzim memegang peranan penting dalam berbagai reaksi di dalam sel. Sebagai protein, enzim diproduksi dan digunakan oleh sel hidup untuk mengkatalisis reaksi, antara lain konversi energi dan metabolisme pertahanan sel. Amilase mempunyai kemampuan untuk memecah molekul-molekul pati dan glikogen Molekul pati yang merupakan polimer dari alfa-D-glikopiranosa akan dipecah oleh enzim pada ikatan alfa-1,4- dan alfa-l,6-glikosida (Biogen, 2008).

Amilase merupakan enzim yang paling penting dan keberadaanya paling besar, pada bidang bioteknologi, enzim ini diperjual belikan sebanyak 25% dari total enzim yang lainya. Amilase didapatkan dari berbagai macam sumber, seperti tanaman, hewan dan mikroorganisme. Amilase yang berasal dari mikroorganisme banyak digunakan dalam industri, hal ini dikarenakan mikroorganisme periode pertumbuhanya pendek. Amilase pertama kali yang diproduksi adalah amilase yang berasal dari fungi pada tahun 1894 (Oliveira, 2008).

Enzim alfa-amilase merupakan enzim yang banyak digunakan pada berbagai macam makanan, minuman dan industri tekstil. Alfa amilase ekstra seluler dihasilkan dari beberapa bakteri, diantaranya adalah Bacillus coagulans, B. stearothermophilus dan B. licheniformis (Biogen, 2008).

2.2 Macam-macam Enzim Amilase

Secara umum, amilase dibedakan menjadi tiga berdasarkan hasil pemecahan dan letak ikatan yang dipecah, yaitu alfa-amilase, beta-amilase, dan glukoamilase. Enzim alfa-amilase merupakan endoenzim yang memotong ikatan alfa-1,4 amilosa dan amilopektin dengan cepat pada larutan pati kental yang telah mengalami gelatinisasi. Proses ini juga dikenal dengan nama proses likuifikasi pati. Produk akhir yang dihasilkan dari aktivitasnya adalah dekstrin beserta sejumlah kecil glukosa dan maltosa. Alfa-amilase akan menghidrolisis ikatan alfa-1-4 glikosida pada polisakarida dengan hasil degradasi secara acak di bagian tengah atau bagian dalam molekul. Enzim beta-amilase atau disebut juga alfa-l,4-glukanmaltohidrolas E.C. 3.2.1.2. bekerja pada ikatan alfa-1,4-glikosida dengan menginversi konfigurasi posisi atom C(l) atau C nomor 1 molekul glukosa dari alfa menjadi beta. Enzim ini memutus ikatan amilosa maupun amilopektin dari luar molekul dan menghasilkan unit-unit maltosa dari ujung nonpe-reduksi pada rantai polisakarida. Bila tiba pada ikatan alfa-1,6 glikosida aktivitas enzim ini akan berhenti. Glukoamilase dikenal dengan nama lain alfa-1,4- glukan glukohidro-lase atau EC 3.2.1.3. Enzim ini menghidrolisis ikatan glukosida alfa-1,4, tetapi hasilnya beta-glukosa yang mempunyai konfigurasi berlawanan dengan hasil hidrolisis oleh enzim a-amilase. Selain itu, enzim ini dapat pula menghidrolisis ikatan glikosida alfa-1,6 dan alfa-1,3 tetapi dengan laju yang lebih lambat dibandingkan dengan hidrolisis ikatan glikosida a-1,4 (Biogen, 2008).

2.3 Substrat dan Kondisi Untuk Sintesis Enzim Amilase

Oliveira (2004) menyatakan bahwa dari sejumlah sumber karbon yang diuji dan ditelitinya, maltosa merupakan substrat yang terbaik untuk produksi protein dan amilase. Umumnya tepung gandum dan tepung jagung juga merupakan sumber karbon yang bagus untuk amilase rizhobia.

Eduardo (2000) dalam penelitianya mengatakan bahwa pada produksi amilase, penambahan kalsium (10 mM) atau pepton 1% pada ekstrak yeast pada mediun mineral, akan memperpendek periode lag dan menambah pertumbuhan dan sintesis amilase. Penambahan glukosa pada kultur mengurangi dari sintesis a-amilase, hal ini bisa disebabkan karena glukosa mempengaruhi kegiatan bakteri ini. Suhu optimum pada sintesis amilase adalah sekitar 50⁰ C dan pH optimum untuk sintesis amilase sekitar 7,0. Ekstrak enzim dipertahankan aktivitasnya 100% ketika diinkubasi selama 1 jam pada suhu 90⁰ C dan 40% pada suhu 60⁰ C selama 24 jam.

Komposisi dan konsentrasi media sangat mempengaruhi produksi dari enzim amilase ekstraseluler pada bakteri, yeast, dan Aspergillus sp. Shinke dalam Srivastava (2008) menyatakan bahwa komposisi medium sangat mempengaruhi produksi amilase, seperti halnya sporulasi pada Bacillus cereus. Keberadaan pati akan menginduksi produksi amilase. Keadaan lingkungan dan sumber nitrogen pada media kultur juga akan mempengaruhi pertumbuhan produksi amilase. Disamping karbon dan nitrogen, sodium dan garam potassium, ion metal, dan detergen juga akan mempengaruhi produksi amilase dan pertumbuhan mikroorganisme (Srivastava, 2008).

2.5 Uji Deteksi Amilase

Degradasi yang terjadi pada pati diketahui dengan hilangnya material yang terwarnai oleh iodine. Uji deteksi α amylase yang menghidrolisis α-1,4-glikogen dan poliglucosan lainnya. Pada saat awal perlakuan terjadi penurunan yang cepat berat molekul pati yang dihasilkan dari pewarnaan iodine. Produk akhir utama dari degradasi ini adalah oligosakarida dengan berat molekul yang rendah. Sebaliknya, β-amilase mampu mengkatalisis sebuah serangan exolitik dan mendegradasi pati dengan cara memecah maltose dari ujung rantai pati. Enzim amylase dari B. subtilis dapat dipisahkan satu sama lain dan secara subsekuen mengeluarkannya bersama maltose. Enzim amylase dapat dipisahkan dari protease dengan menambahkan insoluble starch ke dalam kultur untuk menyerap amilase (Inchem, 2008).

Aktivitas amilase dilakukan oleh enzim bakteri dan terlihat berwarna biru di dalam iodin. Apabila iodin menyebabkan media pati berwarna biru pada koloni bakteri maka tidak ada amilase yang diproduksi. Molekul maltosa yang kecil dapat masuk ke dalam sel untuk digunakan sebagai energi. Interaksi iodin dengan pati membuat media berwarna biru gelap (Goshen, 2008). Menurut Ekunsaumi (2004), produksi enzim amilase oleh koloni bakteri pada media ditunjukkan adanya zona bening dengan penambahan larutan iodin di sekitar koloni bakteri.

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum Deteksi dan Produksi Amilase dilaksanakan pada hari Selasa, tanggal 06 Mei 2008 di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang.

3.2 Alat dan Bahan

Peralatan yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah tabung reaksi, erlemeyer, jarum inokulasi, shaker, spektofotometer, corong buchner, kertas whattman no. 1, sentrifuse dan water bath.

Sedangkan bahan yang diperlukan dalam praktikum kali ini adalah isolat bakteri, bakteri LBPJ 1 dan 9, media NA + 1 % w/v soluble starch, larutan iodin, isolat penghasil amilase, media pemeliharaan, media produksi amilase dan reagen DNS.

3.3 Cara Kerja

3.3.1 Deteksi Bakteri Penghasil Amilase

· digoreskan pada Nutrien Agar yang mengandung 1 % w/v soluble starch dan diinkubasi pada suhu 30 ⁰ C selama 24 jam.

· koloni yang mampu menghasilkan amilase dapat menghidrolisis pati dan akan membentuk zona bening dengan penambahan larutan iodin (gram B).

· bagian yang berwarna hitam menunjukkan masih mengandung pati. Selanjutnya bakteri dipindahkan ke media NA miring yang mengandung 1 % pati untuk dilakukan uji berikutnya.

Hasil

3.3.2 Produksi Amilase

1 oose bakteri

· Ditambahkan ke dalam medium produksi amilase dengan komposisi seperti pada tabel

Komponen	g/l
Bacteriological pepton	6
MgSO₄.7H₂O	0,5
KCl	0,5
pati	1

Medium tersebut dibagi 30-40 mL dan dimasukkan kedalam tabung erlemeyer 50 mL kemudian disterilisasi dengan menggunakan autoclave pada suhu 121⁰ C selama 15 menit.

· Diinkubasikan biakan dengan cara digojok menggunakan shaker selama 72 jam pada kecepatan 120 rpm.

Hasil

Crude enzim

3.3.2 Uji Aktifitas Enzim

· diambil 1 ml dan dimasukkan kedalam tabung reaksi

· ditambahkan 1 mL 2 g/200 ml soluble starch yang telah dilarutkan dalam citrate phospate buffer (pH 6,5)

· diinkubasi pada water bath dengan suhu 40⁰ C selama 30 menit

· sebagai blanko : ditambahkan 2 mL ektrak enzim yang telah didihkan selama 20 menit (pendidihan bertujuan untuk menginaktifkan enzim), ditambahkan kedalam larutan pati dan diperlakukan dengan reagen yang sama dengan tabung aktivitas enzim.

· raksi dihentikan dengan menambahkan 2 mL reagen DNS (1 gr 3,5-dinitrosaliyclic acid, 20 mL NaOH dan 30 gr sodium potasium tartarate dalam 100 mL). dipanaskan selama 5 menit

· ditambah 0,5 ml Na-K-tartarate

· didinginkan dengan air mengalir selama 15 menit

Hasil

diukur adsorbansinya pada panjang gelombang 540 nm

Stok Glukosa 1000 µg/ml

3.3.2 Pembuatan Kurva Baku Glukosa

· dibuat pada berbagai konsentrasi (20, 40, 60..., 200 µl)

· diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan tabung raksi

· ditambah DNS 1,5 ml

· dipanaskan selama 5 menit

· ditambahkan 0,5 Na-K-tartarate

· didinginkan dengan air mengalir selama 15 menit

· diukur adsorbansinya pada panjang gelombang 540 nm

Hasil

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Analisa Prosedur

Pada praktikum deteksi amilase dan uji kualitas amilase digunakan dua jenis bakteri, yaitu LBPJ 1 dan bakteri LBPJ II, hal ini dikarenakan kedua bakteri tersebut adalah bakteri dari lumpur Lapindo yang bisa menghasilkan amilase. Pada preaktikum ini digunakan Nutrien Agar yang mengandung 1% soluble starch, hal ini karena media tersebut merupakan medium untuk pertumbuhan bakteri, selain itu kandungan 1 % soluble starch merupakan sumber pati yang nantinya akan digunakan untuk produksi amilase. Larutan iodin digunakan untuk deteksi adanya amilase dalam medium atau bahan. Hal ini sesuai dengan pernyataan deari Inchem (2008) yang menyatakan bahwa degradasi yang terjadi pada pati diketahui dengan hilangnya material yang terwarnai oleh iodine. Uji deteksi α amylase yang menghidrolisis α-1,4-glikogen dan poliglucosan lainnya. Pada saat awal perlakuan terjadi penurunan yang cepat berat molekul pati yang dihasilkan dari pewarnaan iodin.

Pada deteksi bakteri penghasil amilase, bakteri LBPJ 1 dan 9 digoreskan pada medium NA yang mengandung 1 % soluble starch, hal ini bertujuan untuk menumbuhkan bakteri tersebut pada media yang mengandung pati dan diharapkan bisa menghasilkan amilase. Bakteri yang tumbuh ditambahkan iodin, hal ini bertujuan utnuk mengetahui apakah bakteri tersebut bisa menggunakan pati dan menghasilkan amilase yang bisa dideteksi dengan terbentuknya zona bening disekitar koloni bakteri yang tumbuh.

Pada produksi enzim amilase, digunakan medium standar untuk produksi amilase, yaitu medium yang mengandung bakteriological peptone, MgSO₄.7H₂O, KCl dan pati. Hal ini bertujuan untuk menghasilkan amilase yang optrimal. Biakan bakteri diinkubasi pada shaker dengan kecepatan 120 rpm selama 72 jam. Hal ini dilakukan untuk mengoptimalkan produksi amilase.

Pada uji aktifitas enzim, crude enzim dilarutkan dalam 1 mL 2 g/200 ml soluble starch, hal ini dilakukan karen untuk mengetahui apakah enzim tersebut mampu memcah pati yang ada dalam medium. Kemudian enzim yang telah ditambahkan pati kemudian diinkubasi dalam suhu 40⁰ C selama 30 menit. Hal ini dikarenakan suhu tersebut merupakan suhu optimal enzim dan 30 menit untuk mengoptimalkan kerja enzim. Kemudian selanjutnya reagen DNS yang ditambahkan merupakan reagen yang berfungsi menghentikan kerja enzim. Sehingga enzim tidak memecah pati lagi, sehingga tidak mempengaruhi hasil. Kemudian setelah itu dipanaskan selama 5 menit. Hal ini bertujuan untuk mengoptimalkan kerja DNS dan mempercepat reaksi dari DNS untuk menghentikan kerja amilase. Kemudian didinginkan dengan air mengalir selama 15 menit. Hal ini bertujuan untuk menghilangkan DNS yang telah digunakan untuk menghentikan reaksi amilase. Kemudian diukur adsorbansinya pada gelombang 540 nm. Hal ini untuk mengetahui kandungan enzim yang ada pada media.

Untuk pembuatan kurva baku, dibuat pada berbagai stok glukosa yaitu mulai konsentrasi 20, 40, 60 ..., 200 µl. Hal ini untuk mengetahui seberapa besar kecepatan bakteri untuk menggunakan pati dan berapa besar pengaruh jumlah pati yang diberikan dengan jumlah amilase yang diproduksi.

4.2 Analisa Hasil

Berdasarkan hasil praktikum Deteksi dan Poduksi serta Uji Amilase, dapat dilihat hasilnya sebagaimana berikut ini :

Gambar 4.2.1 Hasil Uji amilase LBPJ 1 dan 9 yang distreak pada NA+soluble starch

Gambar 4.2.2. Hasil Uji amilase LBPJ 1 dan 9 yang distreak pada NA+soluble starch

Pada gambar 4.2.1 tampak adanya zona bening pada daerah disekitar koloni bakteri yang tumbuh dari hasil streak. Pada gambar tersebut nampak bahwa zona bening mengikuti alur arah streak. Zona bening ini terlihat setelah penambahan iodin pada isolat tersebut. Pada gambar tersebut. Zona bening yang terlihat tidak cukup luas, hal ini dapat dilihat bahwa zona bening masih terliat sangat jelas antara garis streakan pertama dan garis streakan kedua. Selain itu pada gambar 4.2.2 dimana bakteri LBPJ yang ditumbuhkan dengan cara dot pada sekitar empat tempat yang berbeda juga menunjukkan hasil yang hampir menyerupai dengan hasil streak, yaitu zona bening yang tumbuh tidak cukup besar, hal ini menunjukkan bahwa amilase yang dihasilkan tidak cukup banyak.

Iodin disini berfungsi sebagai reagen pendeteksi adanya amilase. Pati yang terkena iodin akan berwarna biru, namun pati yang ditambahkan dengan iodin ini akan berubah menjadi bening ketika pada media tersebut terdapat enzim amilase, dimana α amylase pada pati menghidrolisis α-1,4-glikogen dan poliglucosan lainnya. Sehingga Pada saat awal perlakuan, terjadi penurunan yang cepat berat molekul pati yang dihasilkan dari pewarnaan iodin. Produk akhir utama dari degradasi ini adalah oligosakarida dengan berat molekul yang rendah. Sebaliknya, β-amilase mampu mengkatalisis sebuah serangan exolitik dan mendegradasi pati dengan cara memecah maltose dari ujung rantai pati (Inchem, 2008).

Gambar 4.2.3 Contoh Zona bening dari aktivitas amilase

yang dihasilkan oleh yeast (Melliawati, 2006).

Pada gambar 4.2.3 dapat dilihat bahwa zona bening bakteri karena penambahan iodin dan karena adanya amilase yang dihasilkan dari aktiviatas yeast. Dimana pada gambar tersebut dapat dilihat, bahwa zona bening yang dihasilkan dari bakteri tersebut sangat lebar, hal in dapat diketahui dengan mengamati jarak antara koloni bakteri dengan jarak paling luar dari zona bening. Gambar ini menunjukkan bahwa Yeast ini mampu menghasilkan amilase cukup banyak (Melliawati, 2006).

Deteksi keberadaan amilase, selain dengan mengamati zona bening pada media yang mengandung pati dengan menambahkan pati, terdapat metode lain yang bisa digunakan untuk deteksi amilase, yaitu dengan mengukur turunya kandungan gula yang dilepaskan selama reaksi dan mengukur pati sebagai sumber karbon (Shaw, 2008).

DNS merupakan larutan yang mengandung 100 ml mengandung 1 g 3,5 3,5-dinitrosalicylic acid, 30 g potassium sodium tartarate, dan 20 ml 2 N NaOH. Dimana funbgsi DNS ini adalah untuk menghentikan rekasi pada metode deteksi amilase dengan menggunakan metode turunya kandungan gula yang dilepaskan selama reaksi dan mengukur pati sebagai sumber karbon (Shaw, 2008).

Selain itu, terdapat metode yang lainya yang bisa digunakan deteksi keberadaan amilase, yitu metode Fuwa (1954), dimana metode ini menggunakan 50 ml a-amylase yang dilarutkan pada 2 mM imidazole HCl buffer (pH7.0) yang dicampur dengan 100 µl 1.1% soluble-starch dan diinkubasi pada 60°C selama 1 jam. Reaksi dihentikan dnegan penambahan 250 µl stop solution (0.5 N asam asetat : 0.5 N HCl = 5:1). 100 µl aliquote dari reaksi dicampur dengan 1 ml reagen iodin (0.01% iodin dan 0.1% KI). Absorbansi diukur pada panjang gelombang 660 nm setelah inkubasi selama 20 menit. Aktifitas amilase ditentukan dengan mengetahui berkurangnya sejumlah enzim pada poanjang gelombang 660 nm dari 1.0 sampai 10 menit (Shaw, 2008).

Gambar 4.2.4 Kurva Baku Glukosa

Gambar 4.2.4 menunjukkan hubungan antara konsentrasi glukosa dan nilai adsorbansi yang digunakan sebagai acuan antara adsorbansi dan konsentrasi media. Dapat dilihat pada gambar tersebut bahwa nilai adsorbansinya secara berkala tetap stabil dan sebanding antara konsentrasi dan nilai absorbansi sampel dengan konsentrasi glukosa. Dimana, semakin tingginya konsentrasi glukosa pada sampel, maka semakin tinggi pula nilai absorbansi sampel. Hal ini menunjukkan semakin tingginya konsentrasi bahan, akan meningkatkan nilai absorbansinya. Dari sini juga dapat dikatakan bahwa nilai adsorbansi yang tinggi menjukkan tingginya kandungan glukosa pada sampel. Kurva ini meunjukkan linear yang bagus, dimana pada kurva tersebut didapatkan bahwa nilai R-nya mendekati 1 yaitu 0,977. Dimana nilai R yang mendekati 1 atau -1 merupakan nilai regresi yang baik.

Pada pembuatan kurva baku, dimana pada konsentrasi glukosa sekitar 20 dan 40, nilai absorbansinya minus (-), hal ini dimungkinkan karena sedikitnya kandungan glukosa dalam sampel, sehingga glukosa tidak terbaca atau tidak bisa menyerap gelombang cahaya yang dipancarkan, hal ini ditunjukkan dengan nilai absorbansi glukosa mulai terbaca pada sampel dengan konsentrasi glukosa 60 ug/ml.

Tabel 1. Hasil nilai adsorbansi pada masing-masing sampel

Sampel	Meja	Adsorbansi
LBPJ 1	1	0,354
LBPJ 1	2	0,377
Rata-rata		0,3655
LBPJ 9	3	0,4
LBPJ 9	4	0,304
Rata-rata		0,352

Pada tabel 1, dapat dilihat bahwa nilai adsorbansi pada sampel LPBPJ 1 kelompok 1, nilai adsorbansinya adalah 0,354. hal ini jika dicocokan dengan nilai absorbansi pada kurva baku glukosa, maka dapat dilihat bahwa kandungan konsentrasi bahan pada sampel LBPJ 1 adalah sekitar 167 µg/ml. Sedangkan pada sampel LBPJ yang ke-2, nilai adsorbansinya adalah sekitar 0,377. dan hal ini jika dicocokkan pada kurva baku, maka nilai konsentrasi bahan adalah sekitar 170 µg/ml. Jika kedua sampel dirata-rata, maka nilai adsorbansinya adalah sekitar 0,3655, dan jika dicocokkan dengan kurva baku, maka nilai konsentrasi bahan adalah sekitar 168,5 µg/ml. Dari rata-rata nilai konsentrasi ini, maka dapat disimpulkan bahwa nilai kandungan pati dalam bahan masih tinggi, yaitu sekitar 168,8 µg/ml. Hal ini menunjukkan bahwa enzim amilase yang dihasilkan sedikit, sehingga tidak bisa mendegradasi pati cukup banyak. Sedangkan pada sampel kedua, yaitu bakteri lumpur Lapindo LBPJ 9 yang pertama nilai absorbansinya adalah sekitar 0,4. hal ini jika dicocokkan dengan kurva baku, maka konsentrasi bahanya adalah sekitar 175 µg/ml. Dan pada sampel LBPJ 9 yang kedua, nilai adsorbansinya adalah 0,304. jika dicocokkan dengan nilai absorbansi pada kurva baku, maka nilai konsentrasi bahan adalah sekitar 138 µg/ml. Dan jika dirata-rata, maka nilai adsorbansinya adalah sekitar 0,352 µg/ml. Jika dicocokkan pada kurva baku, maka nilai konsentrasinya adalah sekitar 166 µg/ml. Hal ini menujukkan tidak adanya perbedaan yang signifikan antara kedua bakteri tersebut yaitu LBPJ 1 dan 9. kedua bakteri tersebut menujukkan aktifitas amilase yang rendah. Hal ini juga dapat dilihat bahwa pada sampel bakteri yang ditumbuhkan, zona bening yang ada cukup kecil.

Jika dikaitkan dengan aktifitas pada lumpur lapindo, maka dapat dilihat bahwa kandungan lumpur lapindo tersebut sedikit sekali mengandung pati. Hal ini bisa dimungkinkan karena lumpur tersebut merupakan lumpur yang berasal dari perut bumi, sehingga kebanyakan kandungan lumpur adalah logam berat. Berdasar pengamatan, dari sampel lumpur yang diperiksa, ternyata kandungan logam berat, seperti Pb, Cr, Cd, Arsen dan Hg tinggi, sementara Na rendah (Andreas, 2006). Lapindo Brantas Inc (LBI) mengandung Fenol 4 kali lipat lebih besar dari baku mutu (nilai standar) limbah cair yang ditetapkan oleh Surat Keputusan Gubernur Jawa Timur No 45 tahun 2002. Sementara kadar raksa dan nitrit dalam lumpur masing-masing lebih besar 2 dan 6 kali lipat dari SK Gubernur Jatim. Sementara itu, dari hasil Laboratorium Forensik (Labfor) Polri Surabaya menunjukkan bahwa gas lumpur mengandung hidrogen sulfida (H2S) kadar tinggi (Walhi Jatim, 2008).

BAB

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Berdasarkan praktikum yang dilakukan, maka dapat disimpulkan bahwa amilase banyak digunakan pada industri makanan, dimana enzim ini diproduksi mikroorganisme dengan memanfaatkan pati sebagai sumber karbon. Dari hasil praktikum, didapatkan bahwa deteksi amilase bisa dilakukan dengan mengukur zona bening dan bisa juga dengan mengukur turunya gula dan pati sebagai sumber karbon oleh mikroorganisme dengan cara spektrofotomtri. Kedua bakteri yang digunakan sebagai isolat, yakni bakteri LBPJ 1 dan 9 didapatkan bahwa kedua bakteri tersebut memproduksi amilase yang tidak banyak yang diketahui dari zona bening pada media dengan pati dan ditambahkan dengan iodin. Selain itu, hasil praktikum membuktikan bahwa nilai absorbansi kedua isolat hanya sekitar 0,35 dan pada kurva standar, konsentrasi media pada absorbansi tersebut sekitar 167 ug/ml. Hal ini menunjukkan bahwa pada media masih banyak mengandung pati

5.2 Saran

Saran yang dapat diberikan dari praktikum ini adalah sebaiknya praktikum yang selanjutnya tidak hanya menggunakan isolat dari bakteri, namun juga menggunakan isolat dari yeast dan jamur, untuk membandingkan kecepatan produksi pada kedua isolat.

DAFTAR PUSTAKA

Andreas. 2006. Kandungan Logam Berat Dalam Lumpur Lapindo Meningkat. http://www.mediacenter.or.id/pusatdata/27/tahun/2006/bulan/12/tanggal/14/id/1313/ Tanggal akses 17 Mei 2008.

Black, J. G. 2005. Microbiology Principles And Explorations. John Wiley and Sons, Inc. United States America

Biogen, 2008. Amilase. http://biogen.litbang.deptan.go.id/terbitan/agrobio /abstrak/agrobio_vol. tanggal akses 05 Mei 2008.

Ekunsaumi, T. 2004. Laboratory Production And Assay Of Amylase By Fungi And Bacteria. bio-link.org/sharing_day/fungalamylase.pdf

Eduardo, C. 2000. Culture Conditions for the Production of Thermostable Amylase by bacillus sp. http://www.pubmedcentral.nih.gov/picrender.fcgi?artid=203436 &blobtype=pdf. tanggal akses 05 Mei 2008.

Oliveira, 2004. Rhizobia Amylase Production Using Various Starchy Substances as Carbon Substrates. http://www.scielo.br/pdf/bjm/v31n4/a11v31n4.pdf. tanggal akses 05 Mei 2008.

Srivastava, 2008. Culture Conditions for Production of Thermostable Amylase by Bacillus stearothermophilus. http://www.bio-link.org/sharing_day /fungalamylase.pdf. tanggal akses 05 Mei 2008.

Inchem, 2008.Alpha-Amylase From Bacillus Subtilis.http://www.inchem.org/ documents/jecfa/jecmono/v28je05.htm. Tanggal akses 17 Mei 2008.

Goshen. 2008. Amylase Activity. http://www.goshen.edu/bio/Bio 1206/Bio1206Labs/Lab5. Tanggal akses 17 Mei 2008.

Melliawati, r. 2006. Pengkajian Kapang Endofit dari Taman Nasional Gunung Halimun Sebagai Penghasil Glukoamilase. http://journal.discoveryindonesia. com/index.php/hayati/article/viewFile/4/5. Tanggal akses 17 Mei 2008.

Shaw, 2008. Purification and properties of an extracellular a-amylase from Thermus sp.http://ejournal.sinica.edu.tw/bbas/content/1995/3/bot363-08.html. Tanggal akses 17 Mei 2008.

Walhi Jatim. 2008. Kandungan Lumpur Lapindo Ancam Ribuan Nyawa Manusia. http://walhijatim.blogspot.com/2006/07/kandungan-lumpur-lapindo-ancam-ribuan.html. Tanggal akses 17 Mei 2008.

2008-05-17T03:28:00.000-07:00

ISOLASI DNA ORGAN, DARAH , FOLIKEL RAMBUT, FOOLIKEL BULU AYAM

DAN UJUNG EKOR TIKUS

oleh :

Hamdani Mahbub Junaidi

JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MIPA

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

-------------------------------------------------------------------------------------------------

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Deoxiribonucleid acid (DNA) adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun pada tumbuhan. DNA manusia dapat diisolasi melalui darah (Allexperts, 2008). Persiapan pertama untuk melakukan teknik molekuler adalah harus mempunyai bahan dasar berupa DNA / RNA. DNA / RNA bisa kita isolasi dari darah, kultur sel, jaringan tanaman, jaringan lunak atau jaringan keras dari hewan dan manusia (Sentrabd, 2008).

Folikel rambut kaya akan DNA. folikel merupakan bagian rambut yang bagus untuk pengujian DNA. Folikel rambut merupakan bagian dari rambut yang menghubungkan antara rambut dan kulit kepala. Folikel rambut menyediakan objek tes DNA yang terbaik ketika folikel ini didapatakan dalam keadaan masih segar, hal ini berarti ketika rambut ditarik dari kulit kepala. Pengambilan dengan cara ini dengan beberapa helai rambut saja akan mendapatkan DNA yang cukup banyak (Sporgsmaaluk, 2008).

Isolasi DNA penting sekali dilakukan, hal ini akan menunjang kegiatan biologi molekuler yang selanjutnya, sehingga praktikum Isolasi DNA Organ, Darah , Folikel Rambut, Folikel Bulu Ayam dan Ujung Ekor Tikus perlu dilakukan.

1.2 Rumusan Masalah

Permasalahan yang diangkat dalam praktikum ini adalah :

· Dari organ mana saja kita bisa mendapatkan DNA?

· Bagaimana caranya kita mendapatkan DNA tersebut?

· Bagaimana kita bisa mendapatkan DNA dari folikel rambut, organ, darah, folikel bulu ayam dan ujung ekor tikus?

· DNA pada bagian manakah yang didapatkan yang lebih banyak / lebih baik?

1.3 Tujuan

Adapun tujuan diadakanya praktikum Isolasi DNA Organ, Darah , Folikel Rambut, Foolikel Bulu Ayam dan Ujung Ekor Tikus dalah :

· Mengetahui bagaimana mendapatkan DNA

· Mempelajari dan menmperoleh DNA dari organ yang telah ditentukan.

· Mendapatkan DNA yang akan digunakan untuk praktikum selanjutnya.

· Membandingkan DNA pada organ mana yang lebih baik atau lebih banyak didapatkan.

1.4 Manfaat

Manfaat yang dapat diperoleh dari praktikum ini adalah :

· Mengetahui cara isolasi DNA secara baik dan benar

· Mengetahui organ/bagian mana saja dari organisme yang dapat kita isolasi DNAnya

· Mengetahui DNA yang paling bagus dari organ yang telah ditentukan.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa. Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin dan pirimidin. Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki struktur cincin-ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin (T) yang memiliki struktur cincin-tungga. DNA terdapat pada nukleus, mitokondria dan kloroplas. Perbedaan di antara ketiganya adalah: DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua (Allexperts, 2008).

DNA manusia dapat diisolasi melalui darah. Darah manusia terdiri atas plasma darah, globulus lemak, substansi kimia (karbohidrat, protein dan hormon), dan gas (oksigen, nitrogen dan karbon dioksida). Plasma darah terdiri atas eritrosit (sel darah merah), leukosit (sel darah putih) dan trombosit (platelet). Komponen darah yang diisolasi yaitu sel darah putih. Sel darah putih dijadikan pilihan karena memiliki nukleus, di mana terdapat DNA di dalamnya (Allexperts, 2008).

Isolasi DNA darah bisa menggunakan protokol FBI. Sapel darah yang telah dibekukan pada suhu -70⁰ C pada EDTA vacutainer tubes dicairkan, setelah itu ditambahkan sitrate buffer standart ditambah, dicampur dan tabung disentrifuse. Supernatanya dibuang, dan penambahan buffer ditingkatkan, dicampur dan disentrifus lagi. Setelah supernatan dibuang, pelet dilarutkan kembali pada larutan detergent SDS dan proteinase K, dan campuran diinkubasi pada 55⁰C selama satu jam. Sampel kemudian diekstrak fenol sekali dengan menggunakan phenol/chloroform/isoamyl alcohol solution. Setelah sentrifugasi, lapisan berair dibersihkan dari tabung mikrosentrifuse. DNA merupakan precipitate dari ethanol, dilarutkan kembali pada buffer kemudian dipresipitasi dua kali. Pertama kali pengeringan pelet, buffer ditambah dan DNA diinkubasi pada suhu 55⁰ C semalaman, larutan DNA diuji dengan menggunakan polymerase chain reaction.

Folikel rambut kaya akan DNA. Rambut yang rontok dengan sendirinya jika diisolasi DNAnya, maka akan diperoleh hasil yang kurang memuaskan. Oleh karena itu, untuk memperoleh hasil yang maksimal digunakan folikel rambut yang masih segar yang bisa didapatkan dengan mengambil beberapa helainan rambut dari kulit kepala langsung (Sporgsmaaluk, 2008).

Salah satu metode yang digunakan untuk isolasi DNA adalah salting out. Salting out merupakan metode yang digunakan untuk memisahkan protein yang didasarkan pada prinsip bahwa protein kurang terlarut ketika berada pada daerah yang konsentrasi kadar garamnya tinggi. Konsentrasi garam diibutuhkan oleh protein untuk mempercepat keluarnya larutan yang berbeda dari protein satu ke protein yang lainya (Profchm, 2008).

DAFTAR PUSTAKA

Allexperts. 2008. Biologi Molekuler.http://en.allexperts.com/q/ Molecular-Biology-1353/DNA-extraction-using-salting. htm. tanggal akses 12 Maret 2008.

Foundationz. 2008. Hair folicle. http://www.foundationz.co.uk/html /images/Hair%20Follicle.jpg. tanggal akses 12 Maret 2008.

Profchm. 2008. salting out. http://members.aol.com/profchm /saltout.html. tanggal akses 12 Maret 2008.

Roe, B A. 2008. Genomic DNA isolation from blood. http://www. genome.ou.edu/protocol_book/protocol_partIII.html. tanggal akses 12 Maret 2008.

Sentrabd. 2008. Isolasi DNA. http://sentrabd.com/main/info/AT/Dari _Kloning.htm. tanggal akses 12 Maret 2008.

Sporgsmaaluk. 2008. DNA test. http://www.dnatest.dk/sporgs maaluk.htm#FAQ-07. tanggal akses 12 Maret 2008.

Tgfolk. 2008. ffolikel rambut. http://www.tgfolk.net/sites/gtg/hair_ root.gif. tanggal akses 12 Maret 2008.

praktikum Biologi Molekuler

2008-05-17T02:11:00.000-07:00

ISOLASI DNA TANAMAN

oleh :

Hamdani Mahbub Junaidi

JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MIPA

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

----------------------------------------------------------------------------------------------

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Sel-sel tanaman seperti halnya sel-sel hewan, sel-sel tanaman juga mengandung informasi genetik yang nantinya informasi tersebut dapat diturunkan kepada generasi berikutnya. Informasi genetik ini dikode dalam suatu molekul besar DNA yaitu kromosom. Pada sel tanaman ini DNAnya dibagi menjadi DNA intrakromosomal dan ekstrakromosomal. DNA intrkromosomal merupakan DNA yang ditemukan di inti sel. Sedangkan DNA ekstrakromosomal merupakan DNA yang ditemukan di sitoplasma sel. Pada sel-sel tanaman DNA ekstrakromosal ini dapat ditemukan di mitokondria dan kloroplas (Farrel, 2004).

Kemampuan mengisolasi DNA tanaman sangat diperlukan karena sangat bermanfaat dalam kajian ilmu biologi molekuler dan ilmu lainnya. Hal ini berkaitan dengan pemanfaatan hasil analisis dari DNA tanaman yang dapat digunakan untuk berbagai macam hal, seperti mengetahui hubungan kekerabatan, evolusin dan lain seabagainya. Selain itu, kemampuan dalam mengisolasi DNA tanaman juga diperlukan dalam menentukan letak gen-gen yang termutasi pada tanaman transgenik ataupun untuk menentukan letak gen-gen yang mengkode sifat unggul dalam pembatan tanaman tansgenik yang memiliki sifat unggul (Heldt, 2005). Karena pentingnya mengetahui cara mengisolasi DNA tanaman, maka praktikuum tentang Iolasi DNA Tanaman sangat perlu dilakukan.

1.2 Rumusan Masalah

Permasalahan dalam praktikum Isolasi DNA tanaman ini adalah bagaimana cara mengisolasi DNA tanaman tertentu, dan apakah terdapat perbedaan DNA antara DNA tanaman yang satu dengan DNA tanaman yang lainya.

1.3 Tujuan

Tujuan dilaksanakannya praktikum Isolasi DNA Tanaman ini adalah mengetahui cara mengisolasi DNA tanaman yang baik dan benar, serta mengetahui DNA tanaman tertentu.

1.4 Manfaat

Manfaat yang diharapkan setelah dilakukanya praktikum tentang DNA tanaman ini adalah praktikan bisa mengetahui dan bisa mengisolasi DNA tanaman tertentu secara baik dan benar, serta bisa membandingkan DNA antara tanaman yang satu dengan tanaman yang lainya.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Sel tanaman mempunyai tiga genom di dalam selnya, yaitu di dalam nukleus, mitokondria dan plastid. Informasi genetik pada mitokondria dan plastid terletak pada DNA sirkular yang terdiri dari pita double heliks, dengan banyak kopi yang terdapat di tiap organel. Informasi genetik mitokondria dan plastid diturunkan secara maternal dan predominan dari generasi ke generaasi (Heldt, 2005). Isolasi DNA tanaman pada umumnya berhasil bila dilakukan pada tanaman yang masih segar, meskipun isolasi DNA dari tanaman dapat dilakukan pada semua bagian tanaman, embrio bahkan herbarium. Tanaman yang segar bila tidak langsung digunakan harus disimpan pada kondisi yang dingin (-20⁰C atau -80⁰C) dan lembab untuk menjaga kondisi sel tanaman agar DNA yang ada di dalamnya tidak rusak. Salah satu teknik yang digunakan untuk solasi DNA tanaman ini adalah dengan menggunakan CTAB (cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide). CTAB merupakan detergen yang berguna untuk melarutkan membran plasma sel dan akan membentuk komplek dengan DNA. CTAB adalah detergen yang berkation yang akan membentuk komplek presipitasi dengan DNA ketika konsentrasi NaCl di bawah 0,7 M. Presipitasi DNA dari buffer CTAB dengan adanya etanol atau isopropanol sering menghasilkan massa bergelatin yang komposisinya tidak diketahui. DNA pada umumya terlihat jelas dalam massa tersebut, tetapi sulit untuk memisahkannya, sehingga untuk menghindari terbentuknya massa ini digunakan presipitasi yang tidak menggunakan alcohol (Chawla, 2003).

Larutan buffer yang biasa digunakan dalam teknik isolasi DNA tanaman adalah CTAB (Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide). Larutan ini dapat melarutkan membrane plasma dan akan membentuk komplek dengan DNA. Salah satu keunggulan metode ini adalah tidak dibutuhkannya persiapan yang panjang untuk jaringan tanaman dan dapat digunakan untuk berbagai jenis jaringan termasuk daun, akar, biji, embrio, endosperma dan pollen serta kultur suspensi. Metode ini juga dapat diaplikasikan dari ukuran sampel mulai miligram herbarium, jaringan yang telah menjadi fosil hingga beberapa gram jaringan yang baru (Chawla, 2003).

Secara umum metode yang digunakan untuk mengisolasi DNA antara lain sebagai berikut Chawla (2003):

1. Melisiskan dinding sel untuk mengeluarkan isi sel, yang dilakukan dengan menggerus jaringan pada nitrogen cair dengan mortar

2. Mengganggu keseimbangan sel membrane sehingga DNA dapat dikeluarkan ke dalam larutan buffer, dilakukan dengan penggunaan larutan detergen seperti SDS (Sodium Dodecyl Sulfat), CTAB (Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide).

3. Penggunaan EDTA (Etylen Diamine Tetra Acetic Acid) untuk melindungi DNA dari aktivitas endogenous nucleases karena EDTA ini merupakan pengkelat ion yang dibutuhkan sebagai kofaktor sebagian besar nucleases.

4. Campuran jaringan/buffer diemulsi oleh fenol kloroform untuk mendenaturasi dan memisahkan protein dari DNA dan genom DNA dapat dipresipitasi menggunakan ethanol atau isopropanol.

5. Meminimalisasi pemotongan DNA.

Setelah tahapan presipitasi, DNA selanjutnya dipresipitasi dengan menggunakan ethanol absolute. Penambahan larutan garam seperti amonium asetat juga sangat membantu presipitasi DNA. Sedangkan ethanol 70% yang ditambahkan setelah presipitasi ini dapat digunakan sebagai larutan pencuci. DNA hasil kemudian ditambahkan dengan TE dan disimpan dalam frezer suhu -20ºC (Birren dkk, 1997).

Purifikasi DNA dapat diekstraksi menggunakan ekstraksi phenol. Purifikasi ini juga bisa dilakukan dengan menambahkan larutan phenol : chloroform: isoamyalcohol (25:24:1) dengan volume sama dengan volume sampel DNA. Pada lapisan phenol yang merupakan pelarut organik, akan terlarut lipid, polisakarida dan protein. Sampel DNA akan tertinggal pada lapisan aqueous. Chloroform juga merupakan larutan perlarut juga menstabilkan ikatan tidak stabil antara lapisan organik dan aquaeus. Isoamilalkohol juga sebagai larutan penstabil dan mencegah adanya busa (Protocols Online, 2008).

Elektroforesis merupakan teknik yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan fragmen-fragmen DNA ataupun RNA. Prinsip elektroforesis adalah memisahkan molekul berdasarkan muatannya. DNA yang bermuatan negativ karena adanya phosphate akan bergerak ke arah kutub positif selama elektroforesis. Fragmen DNA mempunyai muatan negative yang sama untuk tiap-tiap ukuran panjang, sehingga pergerakan DNA ini akan memiliki kecepatan yang sama untuk mencapai kutub positif (Clark dan Christopher, 2008).

Pergerakan yang sama antar molekul DNA ini tidak akan dapat digunakan untuk memisahkan DNA berdasarkan ukurannya. Hal inilah yang menyebabkan digunakannya gel untuk memperlambat pergerakan DNA. Gel ini merupakan polymer sehingga akan membentuk semacam jaring-jaring untuk memerangkap DNA. DNA dengan ukuran yang lebih besar akan lebih sulit melewati lubang atau pori dari gel, sehingga DNA dengan sendirinya akan terpisah berdasarkan besarnya ukuran karena kemampuan dari DNA yang berbeda-beda dalam melewati pori dalam gel (Clark dan Christopher, 2008).

Biji kacang tanah mengandung kadar lemak dan protein tinggi. Kandungan proteinnya sekitar 25-34%, terdiri dari asam-asam amino esensial seperti arginin, fenilalanin, histidin, isoleusin, leusin, lisin, metionin, triptofan, dan valin. Kandungan lemaknya sekitar 16-50%, 76-86% di antaranya adalah asam lemak tidak jenuh seperti asam oleat dan linoleat. Kacang tanah mengandung anti oksidan, yaitu senyawa tokoferol, selain itu mengandung arakhidonat, dan mineral (Kalsium, Magnesium, Phosphor, dan Sulfur), serta vitamin (riboflavin, thianin, asam nikotinik, vitamin E, dan vitamin A). Kacang tunggak memiliki kandungan protein sekitar 25% (Biogen, 2008).

BAB III

METODE PRAKTIKUM

3.1. Waktu dan Tempat

Praktikum tentang Isolasi DNA Tanaman dilaksanakan pada hari Rabu tanggal 19 Maret 2008, pukul 13.00 WIB-17.00 WIB dilaboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Uneversitas Brawijaya Malang.

3.2. Peralatan dan Bahan

Bahan yang diperlukan dalam praktikum ini adalah daun muda tanaman yang telah dibekukan, CTAB buffer ekstrak (2% CTAB; 100 mM tris-HCl pH 8; 20 mM EDTA pH 8; 1,4 NaCl : disterilkan dengan autoclave, disimpan dalam suhu ruang, kemudian ditambahkan 2 % B-merkaptoethanol; 0,1 mg/mol protein K sesaat sebelum digunakan), PCI (fenol : isoamilalkohol = 25:24:1), nitrogen Cair (N2 liquid), 7,5 ammonium sulfat, EtOH 70 %, TE Buffer (pH 7,6), larutan Ethanol : Kloroform.

Sedangakan peralatan yang digunakan dalam praktikum ini adalah penggerus mortar, eppendorf, vorteks, freezer, water bath, sentrifus, mikropippet, sarung tangan dan masker.

3.3. Cara Kerja

Daun muda yang telah dibekukan dipilih dan diambil sebanyak 0,1 g, digerus dengan nitrogen cair, kemudian ditambahkan 700 µl bufer ekstrak, dipindah ke eppendorf dan divorteks. Kemudian tabung eppendorf yang berisi homogenat diinkubasi dalam water bath 65⁰ C selama 30 menit. Kemudian disentrifus 13000 rpm selama 10 menit pada suhu 4⁰C. Supernatanya dipindahkan ketabung eppendorf baru, kemudian ditambahkan PCl dengan volume sama dan divorteks. Kemudian disentrifugasi 13000 rpm selama 5 menit pada suhu 4⁰C. Supernatanya dipindahkan ketabung eppendorf baru kemudian ditambahkan Cl dengan volume sama dan divorteks. Kemudian disentrifugasi 13000 rpm selama 5 menit pada suhu 4⁰C. Supernatanya dipindahkan ketabung eppendorf baru, kemudian ditambahkan ammonium asetat 7,5 M (0,1 vol) dan divorteks. Diinkubasi selama 1 jam pada suhu -20⁰C. Disentrifugasi 13000 rpm selama 15 menit pada suhu 4⁰C. Supernatanya dibuang kemudian pelet ditambah ethanol 70% sebanyak 500 µl dan dihomogenkan secara perlahan. Setelah disentrifugasi, supernatan dibuang, pelet dikeringkan dalam inkubator suhu 55⁰C. DNA yang berupa pelet dilarutkan dalam 20 µl H₂O. DNA dapat disimpan pada suhu - 20⁰C untuk jangka panjang.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Analisa Prosedur

Dalam praktikum Isolasi DNA Tanaman digunakan lima macam sample kacang, yaitu kacang koro, kacang panjang kuncang tunggak, kacang buncis dan kacang lanjaran, hal ini dilakukan untuk mengetahui perbedaan DNA yang terdapat pada kelima kacang tersebut dan untuk mengetahui tingkat kemurnian isolasi DNA pada kelima kacang tersebut. Kacang-kacang tersebut diambil daun mudanya 0,1 g karena daun mudah dihancurkan dan untuk memperoleh DNA yang aktif beraktifitas. Ditambahkan N₂ cair untuk membekukan daun sehingga mempermudah penggerusan. Kemudian daun-daun tersebut digerus untuk menghancurkan sel daun. Ditambahkan dengan CTAB untuk melysiskan dinding sel, membran sel, menjaga kondisi fisiologi sel dan menjaga pH. Dimasukkan tabung eppendorf dan divorteks untuk mempermudah perlakuan dan untuk menghomogenkan larutan yang terdiri dari fragmen sel dengan CTAB buffer extrak. Diinkubasi dalam water bath 65⁰ C selama 30 menit untuk mengoptimalkan kerja CTAB buffer lysis. Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 10 menit pada suhu 4⁰ C untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan berat molekulnya. Kemudian supernatanya dimashkkan kedalam tabugn eppendorf baru dan ditambahkan PCI dengan volume yang sama dengan supernatan, dimana phenol berfungsi untuk presipitasi DNA, chloro untuk membersihkan saisa fenol, dan Iodin adalah pelarut organik untuk menghilangkan protein.

Larutan yang didapatkan divorteks agar homogen, disentrifuse 12000 rpm 5 menit dalam suhu ruang untuk memisahkan fragmen sel berdasarkan berat molekulnya. Kemudian supernatan diambil dan dipineahkan kedalam tabung eppendorf baru dan ditambahkan dengan CI dengan volume yang sama dengan volume CI, dimana chloro merupoakan pelarut organik yang berfungsi untuk menghilkangkan protein dan iodin berfungsi untuk menghilsangkan fenol. Kemudian divorteks untuk menghomogenkan. Disentrifuse 12000 rpm pada suhu 4⁰ C selama 5 menit untuk memisahkan fragmen DNA dengan debris berdasarkan molekul. Kmeudian supernatanya ditambahkan dengan ammonium asetat dengan volume 0,1 X volume supernatan yang berfungsi untuk salting out, separasi DNA dari RNA, ditambahkan EtOH absolut ),2 X volume supernatan yang berfungsi untuk presipitasi.

Setelah ditambahkan dengan ammonium asetat dan EtOH absolut, larutan divorteks agar homogen. Kemudian diinkubasi pada suhu -20⁰ C selama 2 jam agar kerja ammonium dan EtOH absolut bekerja obtimal. Kemudian disentrifugasi selama 12000 rpm selama 15 menit pada suhu 4⁰ C untuk meisahkan komponen berdasarkan berat molekulnya. Kemudian pelet ditambahkan dengan ETOH 70 % dengan volume 500 µl untuk mencuci DNA dari ethanol absolut dihomogenkan perlahan untuk mencampur larutan, disentrifuse dengan kecepatan 12000 rpm selama 15 menit pada suhu 4⁰ C untuk memisahkan supernatan yang berupa debris dan pelet yang berupa DNA berdasarkan berat molekulnya. Supernatan dibuang dan pelet dikeringkan pada suhu 55⁰ C untuk mendapatkan DNA kering. Pelet ditambahkan 50 µl TE buffer (pH 7,6) yang berfungsi sebagai pelarut DNA. Pada waktu elektroforesis digunakan panajang gelombang 230 karena Panjang gelombang 230 nm merupakan panjang gelombang yang mendekati panjang gelombang maksimum dan memberikan kondisi analisis yang baik untuk analisis DNA tanaman (bebas dari gangguan pelarut) (Harahap, 2007)

4.2 Analisa Hasil

Praktikum Isolasi DNA tanaman ini menggunakan lima macam jenis tanaman kacang-kacangan, yaitu kacang koro, kacang panjang kuncang tunggak, kacang buncis dan kacang lanjaran. Pada praktikum ini dilakukan uji kualitatif dengan menggunakan elektroforesis dan uji kuantitas dengan menggunakan spektrofotometer. Hasil uji kualitatif dapat dilihat pada tabel 1 berikut ini :

Tabel 1. Hasil spektrofotometer dari Isolasi DNA Tanaman.

No	Sample	Å 230	Å 260	Å 280	Kontaminasi polisakarida	Kemurnian	Konsentrasi
No	Sample	Å 230	Å 260	Å 280	Å 230/ Å 260	Kemurnian	Konsentrasi
1	Koro 1	0,072	0,112	0,078	0,643	1,436	1120
2	Koro 2	0,038	0,039	0,028	0,974	1,393	390
3	k. pjg 1	0,094	0,085	0,047	0,106	1,808	850
4	k. pjg 2	0,092	0,013	0,021	7,076	0,619	130
No	Sample	Å 230	Å 260	Å 280	Kontaminasi polisakarida	Kemurnian	Konsentrasi
No	Sample	Å 230	Å 260	Å 280	Å 230/ Å 260	Kemurnian	Konsentrasi
5	Tunggak 1	0,019	0,011	0,031	1,727	0,355	110
6	Tunggak 2	0,084	0,063	0,038	1,333	1,658	630
7	Buncis 1	0,145	0,262	0,145	0,553	1,807	2620
8	Buncis 2	-	-	-	-	-	-
9	Lanjaran 1	0,080	0,010	0,011	8	0,909	100
10	Lanjaran 2	0,069	0,028	0,011	2,464	2,454	280

Data pada table 1 menunjukkan tingkat kontaminasi polisakarida pada isolasi DNA tanaman dan menunjukkan tingkat kemurnian DNA tanaman yang kita isolasi pada konsentrasi tertentu. Dapat dilihat pada tabel tersebut, bahwa tingkat kontaminasi polisakarida yang tertinggi adalah pada kacang lanjaran 1 dan kacang panjang 1 dimana tingkat kontaminasi lanjaran 1 adalah 8 dan nilai kontaminasi kacang panjang 2 adalah 7,076. Sedangkan nilai tingkat kontaminasi yang terendah adalah kacang panjang 1 dengan nilai kontaminasi polisakarida adalah 0,106. sedangkan jika dikaji dari nilai kemurnianya, maka dapt dilihat bahwa sample yang mempunyai nilai kemurnian yang paling tinggi adalah kacang buncis 1 dengan nilai kemurnianya adalah 1,807 dan kacang panjang dengan nilai kemurniaanya adalah 1,808. jika dihubungkan antara kontaminasi polisakarida dan kemurnian DNA maka dapat dilihat bahwa polisakarida sangat mempengaruhi hasil kemurnian isolasi DNA, dapat dilihat bahwa kacang lanjaran 1 dengan nilai kontamisani polisakarida sebesar 8 nilai kemurnian DNAnya adalah 0,909, hal ini berbeda jauh dengan kacang panjang 1 yang mempunyai nilai kontaminasi polisakarida 0,106 mempunyai nilai kemurnian 1,808. sedangkan pada sampel kacang lanjaran 1 nilai kemurnian DNA lebih dari dua, sedangkan nilai kontaminasi menunjukkan 2,464, hal ini kemungkinan tidak hanya polisakarida saja yang mempengaruhi hasil ,namun juga ada faktor lain yang mempengaruhi, misalnya saja RNA.

Bila nilai kemurnian DNA kurang dari 1. 8 menunjukkan adanya kontaminan protein. Sedangkan nilai kemurnian DNA yang diatas 2. 0 menunjukkan kontaminasi oleh RNA. Kontaminasi ini dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor diantaranya adalah kontaminasi dari sampel yang akan diisolasi DNAnya. DNA murni memiliki nilai kemurnian antara 1,8 – 2.0 Nilai kemurnian yang kurang dari 1,8 berarti bahwa DNA tersebut terkontaminasi oleh protein (Clark dan Christopher, 2001).

Keterangan :

1. Kacang koro 1

2. Kacang koro 2

3. Kacang panjang 1

4. Kacang panjang 2

5. Kacang tunggak 1

6. Kacang tunggak 2

7. Kacang buncis 1

8. Kacang lanjaran 1

9. Kacang lanjaran 2

10. Kacang koro 1

11. Kacang koro 2

12. kacang panjang 1

13. kacang panjang 2

14. kacang tunggak 1

15. kacang tunggak 2

16. kacang buncis 1

17. kacang lanjaran 1

Tabel 2. Zimogram hasil elektroforesis

+++

Pada gel hasil elektroforesis yang dilakukan dan skema yang dapat dilihat pada zimogram, maka dapat dilihat bahwa pada sample kacang koro 1 bahwa pada gel semuanya terbentuk smear, hal ini dapat disimpulkan bahwa sample tersebut telah terkontaminasi. Dan pada sample kacang panjang 1 terbentuk band, namun masih terdapat smear yang menandakan bahwa sample masih terkontaminasi, hal yang sama juga ditemukan pada kacang buncis, namun band yang terbentuk lebih tebal. Sedangkan pada kacang lanjaran 1 dan kacang lanjaran 2, band sudah terbentuk dan tidak terdapat smear, hal ini menunjukkan bahwa sample tersebut sedikit terkontaminasi atau bahkan tidak terdapat kontaminasi.

DNA pada saat elektroforesis tidak keluar dengan baik, ada beberapa kemungkinan, diantaranya adalah (Pierroton, 2008) :

1. Tidak terdapat DNA pada sample yang dimasukkan

2. DNA tidak dalam bentuk terlarut (ketika DNA dipresipitasi, banyak terdapat kontaminasi yang tidak disuspensikan kembali menjadi larutan)

3. DNA tidak keluar sama sekali karena sample sangat terkontaminasi protein atau polisakarida dan komponen fenolik

BAB V

KESIMPULAN

5.1 Kesimpulan

Praktikum Isolasi DNA Tanaman menggunakan 5 sample daun tanaman yaitu kacang koro, kacang panjang kuncang tunggak, kacang buncis dan kacang lanjaran. Dari praktikum yang dilakukan, maka didapatkan hasil bahwa sample yang mengalami kontaminasi polisakarida paling banyak adalah kacang lanjaran 1 dan kacang tunggak. Sedangkan sample yang mempunyai tingkat kemurnian yang paling tinggi adalah kacang panjang yaitu sekitar 1,808 dan kacang buncis yaitu sekitar 1,807. sedangkan sample yang mengalami kontaminasi RNA paling tinggi adalah kacang lanjaran 2 yang ditandai dengan nilai kemurnian lebih dari 2 yaitu sekitar 2,464.

5.2 Saran

Pada praktikum ini sebaiknya digunakan sampel tanaman yang berasal dari 1 spesies saja namun beda strain, sehingga bisa diketahui perbedaan masing-masing strain dan mungkin bisa diketahui pula keuntungannya, terutama untuk tanaman transgenik.

DAFTAR PUSTAKA

Birren,B.; E.D. Green; S. Klapholz; R.M. Myers;J. Roskams. 1997. Genome Analysis. A Laboratory manual. Volume 1. Cold Spring Harbour Laboratory Press.New York. Halaman 621

Biogen . 2008 plasma nutfah Indonesia. http:// biogen.litbang.deptan.go.id/berita_artikel/mengenal_plasmanutfah.php. tanggal akses 24 Maret 2008.

Chawla, H. S. 2003. Plant Biotechnology : A Practical Approach. Science Publishers, Inc. Plymouth.

Clark, W. dan K. Christopher. 2008. An Introduction to DNA : Spechtrophotometry, Degradation, and the “Frangekel” Eksperimen http://www. zoo. utoronto. ca/ able/ volumes/ vol-22/5-clark. pdf. Tanggal akses 20 Oktober 2007.

Farrel, R.E. 2004. RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization. Third Edition. Elsevier Academis Press. London. Hal. 693-705

Harahap. 2007. spektrofotometer panjang gelombang 230. jurnal.farmasi.ui.ac.id/pdf/2006/v03n02/hayun0302.pdf. tanggal akses 26 Maret 2008.

Heldt, H. W. 2005. Plant Biochemistry. Third Edition. Elsevier Academic Press. California. Hal. 491

Protocols Online. 2008. Agarose Gel Electrophoresis. http://www.protocol-online.org/prot/Molecular_Biology/ eleectrophoresis/Agarose_Gel_Electrophoresis/index.html. Diakses tanggal 18 Oktober 2007.

Pierroton. 2008. Gel Agarose Trouble Shooting.http://www.pierroton.inra.fr/genetics/labo/protocol.html. tanggal akses 24 maret 2008.

BIOLOGY my Departement

2008-05-17T01:33:00.000-07:00

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Pada umumnya bakteri mempunyai satu kromosom. Kromosom bakteri umumnya berbentuk sirkular atau lingkaran. Disamping memiliki kromosom. Beberapa bakteri mempunyai ektra-kromosomal DNA yang bentuknya juga sirkular namun ukuranya jauh lebih kecil jika dibandingkan dengan ukuran kromosom aslinya. Plasmid dapat mereplikasi sendiri. Jumlah, bentuk, dan ukuran plasmid antar bakteri berbeda antara satu dengan yang lainya, bahkan antar sel dalam satu spesies bakteri (Plattsburgh, 2008).

Isolasi plasmid bisa dilakukan dengan menggunakan metode minipreparasi alkali lisis. Metode ini menggunakan dasar bahwa plasmid mempunyai ukuran yang kecil dan bentuknya melingkar kuat, sedangkan kromosom ukuranya lebih besar dan bentuknya kurang melingkar kuat. Dari hal ini memungkinkan pemilihan secara selektif dengan menggunakan presipitasi (Jmu, 2008). Plasmid penting untuk diisolasi, hal ini untuk karakteristik beberapa bakteri, oleh karena itu, penting sekali dilakukan praktikum tentang Mini-Preparasi DNA Plasmid.

1.2 Rumusan Masalah

Permasalahan dalam praktikum ini adalah bagaimana mengisolasi DNA plasmid dari bakteri dengan menggunakan metode minipreparasi alkali lisis ?

1.3 Tujuan

Adapun tujuan diadakanya praktikum Mini-Preparasi DNA Plasmid adalah untuk mempelajari bagaimanakah cara mendapatkan DNA plasmid dari bakteri yang telah diinokulasi sebelumnya dengan baik dan benar.

1.4 Manfaat

Manfaat yang diharapkan dari diadakanya praktikum ini adalah bisa mendapatkan DNA plasmid dari bakteri yang telah diinokulasikan sebelumnya serta bisa menerapkan isolasi DNA plasmid dengan menggunakan metode minipreparation.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Plasmid merupakan potongan melingkar DNA yang ukuranya kecil (kurang lebih 2000 sampai 10000 pasangan basa) yang berisi informasi genetik yang penting untuk pertumbuhan bakteri. Di alam, gen informasi ini sering mengkode protein yang akan membuat bakteri resisten terhadap antibiotik. Plasmid mungkin merupakan hasil dari perkembangan heterothrop yang tertutup. Bakteri sering tumbuh pada lingkungan yang sama dengan mold dan fungi dan berkompetisi dengan mereka untuk mendapatkan makanan (bahan organik komplex). Sebagai hasilnya, mold dan fungi menghasilkan toksin untuk membunuh bakteri (dalam dunia kedokteran sering deisebut dengan antibiotik) agar supaya menang dalam memperebutkan makananya. Untuk menanggapi ini bakteri mengahsilkan plasmid untuk mempertahankan hidupnya (Jakubowski. 2008). Plasmid adalah DNA untai ganda yang berbentuk sirkuler yang berada diluar DNA kromosomal bakteria. DNA ekstrakromosomal yang etrjadi secara alamiah pada bakteria, yeast, dan beberapa sel eukaryotik yang berada secara simbiotik maupun parasitik pada sel inang. Ukuran plasmid DNA lebih dari 100 kb. Sebagaimana sel inang yang menggandakan DNA kromosomal, sebelum membelah plasmid juga melakukannya (Lodish, dkk, 2004).

Dalam dunia rekombinasi, plasmid yang sering digunakan adalah plasmid dari bakteri E. coli, hal dikarenakan plasmid pada bakteri ini adalah plasmid yang mempunyai ukuran yang cukup panjang, sehingga ketika direduksi, maka plasmid ini akan menghasilkan ukuran sekitar 3 bp panjangnya (Lodish, 2000). Isolasi plasmid bisa menggunakan metode minipreparation, dimana metode ini digunakan untuk menekstrak DNA plasmid dari suspensi sel bakteri dan didasarkan pada prosedur alkalin lysis yang telah dikembangkan oleh Birnboim and Doly (dalam penelitianya tentang asam nukleat 7:1513, 1979) (Rachdie. 2008).

Gambar 1. Plasmid (Premierbiosoft. 2008).

Dua tipe utama prosedur yang digunakan untuk memurnikan DNA adalah sentrifugasi dan ekstraksi secara kimiawi. Prinsip-prinsip dari sentrifugasi adalah dengan memisahkan molekul berdasarkan ukuran dan berat molekul. Sampel yang disentrifugasi dengan kecepatan tinggi dan gaya sentrifugal menyebabkan komponen yang lebih besar dan lebih berat akan terendap di dasar tabung yang biasa disebut dengan pelet, sedangkan molekul yang ukuran dan beratnya lebih kecil akan berada pada lapisan yang atas yang biasa disebut dengan supernatan. Sebagai contoh, pemecahan sel bakteria dengan menggunakan lysozim dan detergen akan menghasilkan larutan yang mengandung fragmen-fragmen dinding sel yang lebih kecil dan fragmen DNA yang merupakan molekul raksasa. Apabila larutan tersebut disentrifugasi maka DNA dan beberapa komponen besar lainnya akan mengendap di dasar tabung sentrifus. sedangakan fragmen dinding sel bersama dengan berbagai komponen larut lainnya bercampur pada supernatan (Calladine,. 2004).

supernatant is transferred to a new tube, and the plasmid or cosmid DNA is precipitated by the addition of polyethylene glycol and collected by centrifugation

Metode yang digunakan untuk isolasi DNA plasmid dan cosmid adalah menggunakan alkalin lysis. Secara singkatnya, sel yang akan diambil bagian plasmidnya diambil dengan mengguanakan sentrifugasi, diinkubasi dengan menggunakan lysosim buffer, dan diperlakukan dengan menggunakan alcaline detergent. Protein yang terlarut dan membran dipresipitasi dengan menggunakan presipitate lysat dibersihkan dengan filtrasi dari presipitat melalui cheesecloth dan kemudian disentrifugasi .

Calladine, C. R., Horace R D., Ben F L., Andrew A T. 2004. UNDERSTANDING DNA. Academic Press. Amsterdam.

Jmu. 2008. DNA Plasmid Miniprep Protocol. http://csm.jmu.edu/ biology/courses/bio480_580/mblab/miniprep.html. tanggal akses 12 Maret 2008.

Jakubowski. 2008. plasmid. http://employees.csbsju.edu/ hjakubowski/classes/ch331/dna/oldnalanguage.html&h=554&w=450&sz=29&tbnid=54iFDIdzPo7aeM:&tbnh=133&tbnw=108&prev=/images%3Fq%3Dplasmid%26um%. tanggal akses 12 Maret 2008.

Lodish, H., Arnold B., S. Lawrence Z., Paul M., David B. James D. 2000. MOLECULAR CELL BIOLOGY. Wh Freeman Company

Premierbiosoft. 2008. gambar plasmid. http--www_premierbiosoft_com-images-plasmid_maps_gif. Tanggal akses 12 Maret 2008.

Plattsburgh. 2008. Plasmid. http://faculty.plattsburgh.edu/ donald.slish/figures/Bluescript.GIF&imgrefurl=http://faculty.plattsburgh.edu.pdf

Rachdie. 2008. isolasi plasmid. http://rachdie.blogsome.Com /2006/11/02/teknik-dasar-analisa-biologi-molekuler-2/. Tanggal akses 12 Maret 2008.

Roe, BA. 2008. genom education. http://www.genome .ou.edu/protocol_book/protocol_partIII.html. Tanggal akses 12 Maret 2008.